Producció i caracterització bioquímica de la lacasa NRC 620 de bolet d'ostra i avaluació de la seva eficiència en la clarificació del suc de poma.

Després de 25 dies d'incubació estàtica a 28 °C, la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC620 va mostrar la màxima activitat en el medi de cultiu fúngic. Els valors òptims de pH i temperatura per a aquest enzim van ser 3,0 i 70 °C, respectivament. Després de 2 hores d'incubació a 40 °C i 50 °C, l'activitat enzimàtica es va mantenir al 68,33% i 59,61%, respectivament. Després de 2 hores d'incubació en tampó citrat-fosfat (pH 7,0), l'activitat enzimàtica es va mantenir al 100%. L'addició de 10 mM de MgSO₄ i CuSO₄ va augmentar l'activitat enzimàtica aproximadament un 21% i un 35%, respectivament, mentre que NaCl, MnCl₂, KCl i CaCl₂ van inhibir l'activitat enzimàtica. Utilitzant ABTS com a substrat, els paràmetres cinètics (Km i Vmax) de la lacasa *Pleurotus ostreatus* NRC 620 van ser 1,99 mM i 16.217 μmol min−1 L−1, respectivament. El tractament enzimàtic de mostres de suc de poma va reduir significativament tant el pH com la viscositat, i aquesta reducció es va correlacionar amb un augment del temps d'emmagatzematge. El tractament amb la lacasa va provocar una lleugera disminució del contingut fenòlic total del suc de poma, però no es va observar cap reducció de l'activitat antioxidant.
En els darrers anys, els investigadors s'han centrat en l'aplicació de la biotecnologia verda a la indústria alimentària. La lacasa és un dels enzims més útils en la indústria alimentària, i troba aplicacions en àrees com el processament de sucs, la forneria, l'estabilització del vi i la millora de les qualitats organolèptiques dels productes alimentaris.¹Moltes plantes superiors i microorganismes secreten lacasa,²i fongs com els deuteromicets, els ascomicets i els basidiomicets també poden produir lacasa.³La lacasa (EC 1.10.3.2) és una oxidasa blava que redueix l'oxigen molecular a aigua mitjançant un sistema que consta de tres àtoms de coure diferents, oxidant així diversos compostos fenòlics i amines aromàtiques. Durant la producció de sucs de fruites i verdures, l'enfosquiment enzimàtic i no enzimàtic són problemes crítics.⁴Com que aquestes substàncies afecten negativament el color, el sabor i l'aroma del suc, s'han d'eliminar.⁵
De totes les fruites, les pomes són les més consumides a tot el món i a la Unió Europea. El 2019, la producció de pomes va ocupar el tercer lloc a nivell mundial, superant els 87 milions de tones.⁶Les pomes contenen nombrosos compostos fenòlics, incloent-hi flavonoides i àcids fenòlics com l'àcid cafeic i l'àcid clorogènic.⁷Com que el suc de poma es consumeix normalment en la seva forma clara, aproximadament entre el 50% i el 90% dels components fenòlics es perden durant el procés de filtració.⁸Avui dia, els consumidors tendeixen a triar productes mínimament processats, com ara el suc de poma tèrbol amb un alt contingut en polifenols. Tanmateix, a causa del seu alt contingut fenòlic, aquest tipus de suc de poma és particularment susceptible a la decoloració i l'enfosquiment.⁹Diverses tecnologies, inclosos mètodes de tractament tèrmic com la pasteurització a 60–90 °C, s'utilitzen per reduir o evitar l'enfosquiment del suc de poma.¹⁰Tanmateix, segons la investigació de Sauceda-Gálvez¹¹, el processament tèrmic pot destruir els productes químics volàtils i afectar les qualitats organolèptiques del suc de poma. Les alternatives als mètodes de processament tèrmic inclouen el diòxid de carboni supercrític, la radiació ultraviolada, els ultrasons, l'alta pressió hidrostàtica o l'homogeneïtzació a alta pressió.¹²L'eficiència d'aquestes tecnologies i el rendiment de sucs de fruita adequats depenen dels paràmetres utilitzats i de les característiques del producte. El seu ús generalitzat està limitat per costos elevats, efectes adversos sobre la qualitat d'alguns productes alimentaris o una inactivació enzimàtica inadequada.^13,14
La lacasa es pot utilitzar per estabilitzar i clarificar el suc de fruita.¹⁵Gökmen et al.¹⁶recomanen l'ús de lacasa per a la clarificació del suc de fruita perquè elimina eficaçment els compostos fenòlics convertint-los en polímers o oligòmers que s'eliminen fàcilment per qualsevol membrana d'ultrafiltració, permetent que el suc de poma mantingui un color i una claredat estables durant un màxim de sis setmanes a 50 °C. La lacasa purificada de *Trichoderma* es va immobilitzar en perles d'alúmina i es va utilitzar per eliminar selectivament els compostos de mal sabor causats per la contaminació microbiana del suc de poma.¹⁷
Aproximadament el 80-90% dels components volàtils del suc de poma són èsters i aldehids, que li confereixen una aroma única.¹⁸La lacasa de *Trametes versicolor* es va immobilitzar sobre un suport econòmic fet de fibra natural de closques de coco joves per a la clarificació del suc de poma.¹⁹Estudis anteriors han investigat l'estabilització del suc de poma (color i terbolesa) mitjançant mètodes sense enzims o d'immobilització, o en combinació amb ultrafiltració.^5,19Tanmateix, l'efecte de les lacases fúngiques sobre les propietats fisicoquímiques del suc de poma durant l'emmagatzematge encara no està clar. Per tant, l'objectiu d'aquest estudi va ser investigar experimentalment els canvis en les propietats fisicoquímiques, el contingut de compostos fenòlics i l'activitat antioxidant del suc de poma després del tractament amb lacases fúngiques i l'emmagatzematge refrigerat de dues setmanes. Les lacases tenen la capacitat d'oxidar els compostos fenòlics, cosa que les fa prometedores per al seu ús en diversos processos industrials, inclosa la clarificació del suc. Aquest estudi va examinar les lacases de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, centrant-se en les condicions ideals per a la seva activitat i eficàcia en la clarificació del suc. Si bé la recerca sobre els bolets ostra (P. ostreatus NRC 620) encara és limitada, estudis anteriors han examinat enzims de diverses fonts fúngiques, com ara Trametes versicolor i Ganoderma lucidum. L'objectiu d'aquest estudi va ser avaluar l'aplicació potencial d'aquest enzim en la indústria alimentària i destacar les seves propietats úniques, en particular el seu pH i temperatura ideals.
L'àcid 2,2′-azooxibis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfònic) (ABTS) es va adquirir a Sigma-Aldrich (Canadà). Tots els altres reactius eren de grau analític.
El Centre de Recollida de Cultius Microbians del Centre Nacional de Recerca va obtenir la soca coneguda de bolet ostra NRC620. Després del subcultiu, aquesta soca es va emmagatzemar en plaques inclinades d'agar amb dextrosa de patata a 4 °C. El mètode de preparació de l'inocul va ser el següent: es va inocular miceli completament desenvolupat de 10 dies d'edat en plaques d'agar amb dextrosa de patata i es va incubar a 28 °C. Després de 10 dies, es van treure tres blocs micelials de 12 mm de diàmetre del medi d'agar utilitzant un punxó metàl·lic estèril i es van col·locar en matrassos Erlenmeyer de 250 ml amb taps de cotó que contenien 50 ml de medi de cultiu esterilitzat (pH 5,0, tal com es va descriure anteriorment per Othman et al.²⁰). Els cultius es van incubar a 28 °C durant 18 dies. A continuació, els cultius es van filtrar a través de paper de filtre Whatman núm. 1 i el sobrenedant resultant va servir com a font d'enzim.
L'activitat de la lacasa es va determinar utilitzant ABTS com a substrat. La mescla de reacció (2 mL) contenia 500 μL d'ABTS 0,3 mM (dissolt en tampó de citrat de sodi 0,1 M, pH 4,5) i la quantitat necessària de mostra d'enzim diluïda amb aigua destil·lada.^21,22Considerant que la lacasa pot oxidar ABTS a temperatura ambient (28 °C ± 2), l'oxidació d'ABTS es va determinar mesurant l'augment de l'absorbància a 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm³^-1 M ^-1) utilitzant un espectrofotòmetre UV Agilent Carry-100. Es va requerir una unitat d'activitat lacasa per oxidar 1 μmol d'ABTS per minut. La concentració de proteïnes es va determinar mitjançant el mètode de Bradford utilitzant albúmina sèrica bovina com a control intern.^23,24
Després d'obtenir l'enzim de la soca de bolet ostra NRC 620, se'n va mesurar l'activitat a diferents intervals de cultiu durant 25 dies en condicions estàtiques a 28 °C.
Per estudiar l'efecte de la temperatura sobre l'activitat de la lacasa, es van dur a terme experiments en un interval de temperatura de 20 a 90 °C. Abans d'afegir l'enzim i iniciar la reacció, es van barrejar el tampó (citrat de sodi 0,1 M, pH 4,5) i el substrat (ABTS) i es van incubar durant 5 minuts a diverses temperatures. L'estabilitat tèrmica de l'enzim es va avaluar mitjançant la incubació en tampó de fosfat de sodi 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 i 70 °C durant 2 hores, respectivament. A continuació, es va avaluar l'activitat residual utilitzant el substrat ABTS.
L'efecte del pH sobre l'activitat de la lacasa es va avaluar utilitzant ABTS com a substrat en tampons citrat-fosfat 0,1 M amb un rang de pH de 2,5 a 7,0. La solució enzimàtica es va incubar a 40 °C durant dues hores en tampons citrat i Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 i 7) per avaluar l'estabilitat del pH. L'activitat residual amb ABTS com a substrat es va calcular després de la incubació.
La lacasa es va incubar durant 10 minuts en tampó de fosfat sòdic (0,05 M, pH 7,0) que contenia diversos ions metàl·lics (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ i Mn2+) a concentracions de 2,5 mM i 10 mM, respectivament. A continuació, es va afegir el substrat (ABTS) per iniciar la reacció i es va avaluar l'activitat relativa.
L'oxidació d'ABTS per lacasa a diverses concentracions (0,025–3 mM) es va mesurar a pH 4,5 per determinar els paràmetres cinètics (Vmax i Km). La cinètica^constantsde l'equació de Michaelis-Menten es van calcular mitjançant un gràfic de Lineweaver-Burk, que representa el recíproc de la velocitat de reacció en funció de la concentració del substrat. Les constants cinètiques es van calcular a partir del gràfic de Lineweaver-Burk utilitzant el programari GraphPad Prism versió 6.01.
Després de rentar a fons les pomes amb aigua de l'aixeta, es van tallar per la meitat i es van espremer amb un espremedor de poma Braun MP80 totalment automàtic (fabricat a Alemanya). El suc es va filtrar a través de quatre capes de gasa. No es van afegir enzims al grup de control, mentre que es va afegir un 2,0% de lacasa (la concentració més efectiva provada) al suc de poma acabat de preparar, que després es va emmagatzemar a 4 °C durant dues setmanes.
L'acidesa titulable (AT) i el pH es van determinar segons el mètode de Boulton et al.^al.27El pH de cada mostra es va mesurar amb un pH-metre digital (pH-metre JENWAY 3510). L'acidesa titulable (AT) es va calcular en funció de l'àcid màlic mitjançant la fórmula següent.
On V i C són el volum (mL) i la concentració (0,1 mol/L) de la solució d'hidròxid de sodi utilitzada en la valoració, respectivament. K és el coeficient de conversió de l'àcid màlic, igual a 0,067, i W és la massa (g) del suc de poma.
Els sòlids solubles totals (^TDS) de totes les mostres de suc es va determinar mitjançant un refractòmetre de butxaca PAL-1 (ATAGO, Tòquio, Japó). Després de cada mesura, la lent òptica es va esbandir amb aigua desionitzada i cada mostra de suc de poma es va analitzar tres vegades. El valor de cada mostra es va calcular fent la mitjana de les tres mesures. La mitjana ± desviació estàndard per a cada mostra de suc de poma també es va calcular fent la mitjana d'aquests resultats.
La viscoelasticitat de les mostres de suc de poma es va avaluar mitjançant un viscosímetre rotacional (RV, Rheotest 2, Alemanya). La mostra es va col·locar dins del cilindre "S2" del viscosímetre. La viscositat aparent es va representar pel pendent de la corba de tensió de cisallament versus velocitat de cisallament, que es va calcular a partir de la tensió de cisallament i les corbes corresponents a diverses velocitats de cisallament (d'1,00 a 437,4 s⁻¹). La fórmula per calcular la viscositat aparent és la següent:
On η és la viscositat aparent (cP), τ és la tensió de cisallament (dyn/cm²), γ és la velocitat de cisallament (sec⁻¹) i (τ) es calcula utilitzant els valors del parell de tracció (α) i del cilindre (Z) utilitzant la fórmula següent: τ = Z . α.
L'índex de bruniment es va determinar segons el mètode de Meidav ​​et al.^al.29Es va centrifugar una mostra de suc de 10 ml a 2750 xg durant 10 min. Es van barrejar 5 ml del sobrenedant del suc amb 5 ml d'etanol al 95%. L'absorbància de la mescla es va mesurar a 420 nm amb un espectrofotòmetre UV Shimadzu (UV-1601 PC).
El contingut fenòlic total (TPC) es va determinar colorimètricament utilitzant el reactiu de Folin-Ciocalteu tal com descriuen Boulton et al.^[27]. Es va construir una corba estàndard d'àcid gàl·lic per a concentracions de 0 a 500 mg/L (^r²= 0,997). Els resultats s'expressen com a equivalents d'àcid gàl·lic (mg GAE/mL).
Afegiu 125 μL d'aigua destil·lada i 2850 μL de solució FRAP a 25 μL de suc de poma i deixeu la barreja a les fosques durant³⁰min. A continuació, mesureu l'absorbància a 593 nm utilitzant un espectrofotòmetre UV Shimadzu (UV-1601 PC). El reactiu FRAP es va preparar barrejant 300 mM de tampó acetat (pH 3,6), 20 mM de clorur de ferro(III) i 10 mM de 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) (dissolta en HCl 40 mM) en una proporció de 10:1:1. Es va generar una corba estàndard utilitzant Trolox com a estàndard (^R²= 0,999), i els resultats s'expressen com a μM Trolox/mL.
L'activitat antioxidant dels sucs tractats i no tractats es va determinar mitjançant el mètode DPPH per avaluar la seva capacitat per eliminar els radicals lliures de DPPH.³¹Es van barrejar deu microlitres de suc amb 1 ml d'una solució de DPPH (100 μM) en metanol. Després de la reacció a les fosques durant 30 minuts, es va mesurar l'absorbància de la mescla a 517 nm utilitzant un espectrofotòmetre UV Shimadzu (UV-1601 PC). Els resultats es van expressar com a equivalents de trolox (μM trolox/ml) basats en una corba de calibratge (_^R2= 0,990).
Les dades obtingudes van mostrar que es va observar la producció màxima de lacasa en els bolets ostra NRC 620 al final del dia 18 de fermentació, assolint una activitat de 1302 U/L. Això va servir com a base per determinar el temps de cultiu òptim per a la producció de lacasa (Figura 1). Tot i que la producció d'enzims va augmentar amb l'augment del temps de cultiu, la taxa d'augment no va ser directament proporcional al temps de cultiu; després de 21 dies, l'activitat enzimàtica només havia augmentat en 90 U/L (fins a 1390 U/L). Per tant, finalment es va seleccionar 18 dies com el temps de cultiu òptim per equilibrar el rendiment del producte amb els beneficis econòmics de l'augment del temps de cultiu.
Efecte del temps de cultiu sobre el rendiment de la lacasa en Pleurotus ostreatus NRC 620. Es van inocular tres blocs micelials fúngics (12 mm) en 50 ml de medi estèril i després es van cultivar a 28 °C durant diferents temps.
D'acord amb altres estudis, els nostres resultats indiquen que el període de cultiu ideal per aconseguir el màxim de secreció de lacasa per fongs probablement sigui entre 7 i 36 dies.³²Segons Ezike et al.³³, *Trametes polyzona* WRF03 va produir la quantitat més alta de lacasa al final del novè dia de fermentació, amb una activitat específica de 1637 U/mg de proteïna. A més, Othman et al.³⁴es va descobrir que *Trichoderma harzianum* S7113 secretava una gran quantitat de lacasa el cinquè dia de cultiu. La taxa de producció de lacasa va assolir un pic d'activitat el catorzè dia i després va disminuir gradualment.³⁴Tot i que la secreció d'enzims també es pot produir durant la fase principal de creixement, normalment arriba al seu màxim durant la fase intermèdia i es desencadena pel consum d'una font de carboni o nitrogen.^34,35
Tot i que la lacasa de Pleurotus ostreatus NRC 620 va mostrar una alta activitat en un ampli rang de temperatures de 50 °C a 80 °C, a prop de l'activitat màxima (69–98%), la seva activitat màxima es va observar a 70 °C (Fig. 2a). Fora d'aquest rang de temperatures, l'activitat enzimàtica va disminuir aproximadament a 70 °C. Aquests resultats suggereixen que l'enzim és actiu a altes temperatures, probablement perquè l'alta temperatura augmenta l'energia cinètica de la reacció.
Efecte de la temperatura de reacció (a) i el pH (b) sobre l'activitat lacasa en *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Es van aconseguir temperatures d'entre 20 i 90 °C preincubant la mescla a diferents temperatures durant 5 minuts abans d'afegir l'enzim i iniciar la reacció. L'efecte del pH sobre l'activitat lacasa es va avaluar utilitzant ABTS com a substrat en solucions que contenien tampó citrat-fosfat 0,1 M en un rang de pH de 2,5 a 7,0.
Segons Ezike et al.^al.33, la temperatura òptima per a la lacasa *Trametes polyzona* WRF03 és de 55 °C, que és la mateixa que la de *Ganoderma lucidum*^laccase36i similar a la temperatura òptima (50 °C) per a *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lacasa . ^Baldrian38assenyala que, com passa amb altres sistemes enzimàtics que degraden la lignina, el rang de temperatura ideal per a la lacasa és entre 50 i 70 °C.
Els resultats van mostrar que l'enzim va exhibir la màxima activitat a pH 3.0, arribant al 94% d'activitat a pH 3.5. No obstant això, va romandre actiu en un ampli rang de pH de 2.5 a 7.0 (Figura 2b). A més, va exhibir una major activitat en condicions àcides en comparació amb condicions neutres o alcalines. La seva activitat es va mantenir com a mínim del 77% en el rang de pH de 2.5 a 4.5, però només va arribar aproximadament al 38% a pH 7.0. El pH òptim per a la lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 va ser 4.533, que és el mateix que el pH de les lacasas de *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 i *Trametes hirsuta* 41. No obstant això, segons l'estudi de Chairin et al.⁴², el pH òptim per a la lacasa de *Polymorpha f. sp.* WR710-1 és de 2,2, mentre que el pH òptim per a la lacasa de *Polymorpha f. sp.* IBL-04 és de 5,043. La unió d'anions hidròxid (inhibidor de la lacasa) als àtoms de coure de la lacasa T2/T3 pot ser la raó de la disminució de l'activitat de la lacasa en condicions de pH neutre o alcalin. Això pot interrompre la transferència interna d'electrons del centre T1 al centre T2/T3, i per tant^limitantl'activitat enzimàtica23,44
En incubar l'enzim a diferents temperatures, es va descobrir que tant el temps d'incubació com la temperatura afectaven l'estabilitat de l'enzim. Cal destacar que la lacasa de *Trametes polyzona* NRC 620 va mostrar una major estabilitat a 40℃ i 50℃, conservant el 68,33% i el 59,61% de la seva activitat inicial, respectivament, després de 120 minuts (Figura 3a). En canvi, en les mateixes condicions (40℃ i 50℃, 120 minuts), la lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 va conservar el 64,38% i el 42,92% de la seva activitat, respectivament.³³Per contra, l'augment del temps i la temperatura d'incubació va disminuir l'estabilitat de la lacasa *Trametes polyzona* NRC 620; Després de la incubació a 60 ℃ i 70 ℃ durant 60 minuts, la seva activitat va disminuir fins al 39,24% i l'1,72%, respectivament (Figura 3a). D'acord amb els resultats experimentals, la lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 va mostrar una major estabilitat a 40 i 50 ℃ durant tot el procés de tractament tèrmic.³³De la mateixa manera, Lueangjaroenkit i altres^al.37i Chairin i altres^al.42va informar de l'estabilitat de les lacases de Trametes polyzona KURNW027 i Trametes polyzona WR710-1 a 50 °C durant 1 hora, respectivament. Com a biocatalitzador útil aplicable en diversos camps biotecnològics, la lacasa hauria de tenir una bona estabilitat i rendiment en un ampli rang de temperatures.
Estabilitat termostàtica (a) i estabilitat del pH (b) de la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620. L'estabilitat termostàtica es va avaluar incubant la solució enzimàtica en tampó de fosfat de sodi 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 i 70 °C durant 2 h, respectivament. L'estabilitat del pH es va avaluar incubant la solució enzimàtica en tampó de citrat 0,1 M i tampó Tris (pH 3, 4, 6 i 7) a 40 °C durant 2 h. L'activitat residual es va calcular utilitzant ABTS com a substrat després de la incubació.
Per determinar les condicions òptimes per a l'ús i l'emmagatzematge d'enzims, vam investigar l'efecte del pH sobre l'estabilitat de la lacasa. L'exposició a diferents valors de pH va afectar significativament l'estabilitat de l'estructura de la proteïna, influint així en l'estabilitat i l'activitat de la molècula d'enzim. Els resultats van mostrar que l'enzim era menys estable en condicions àcides, mentre que va demostrar una millor estabilitat a valors de pH més alts (regions neutres i alcalines). A valors de pH de 7.0, 6.0, 4.0 i 3.0, les taxes de retenció de l'enzim després de 120 minuts van ser aproximadament del 100%, 62.54%, 52.39% i 11.14%, respectivament (Fig. 3b). La lacasa *Strombus multisus* WRF03 va mostrar una major estabilitat a valors de pH neutre (5.5–6.5) i una menor estabilitat a valors de pH àcid (per sota de 4.0). Després de 120 minuts a valors de pH de 5,5, 6,0 i 6,5, les taxes de retenció de l'enzim van ser aproximadament del 82%, 100% i 93%, respectivament.³³Khairin et al.⁴²va observar que la lacasa de Trametes polyzona WR710-1 era estable en el rang de pH de 6,0 a 7,0, mentre que Sayed et al.⁴⁵va mostrar que la lacasa era més estable en condicions de pH neutre. No obstant això, la lacasa de Cerrena unicolor també va mostrar estabilitat en condicions alcalines (pH 9.0)⁴⁶Les lacases estudiades van mostrar una alta estabilitat en un ampli rang de pH. Això pot ser una característica important per a aplicacions industrials.
Com que alguns ions metàl·lics tenen efectes estimulants i inhibidors sobre l'activitat enzimàtica, els seus efectes sobre l'activitat enzimàtica s'han de tenir en compte en aplicacions industrials. Això és crucial perquè els ions metàl·lics són contaminants ambientals comuns que poden afectar l'estabilitat i la síntesi dels enzims extracel·lulars.⁴⁷Per investigar els efectes de múltiples ions metàl·lics sobre la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, vam dur a terme els experiments corresponents. Com es mostra a la Figura 4, depenent del tipus de metall utilitzat, augmentar la concentració d'ions metàl·lics de 2,5 mM a 10 mM va afectar negativament la funció enzimàtica. Per exemple,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, i^Cu²⁺podria estimular i activar l'activitat enzimàtica, mentre que^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, i^K⁺podria inhibir l'activitat enzimàtica. A una concentració de 10 mM, els ions Cu²⁺ i Mg²⁺ van ser els activadors més potents de l'activitat lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, proporcionant un grau d'activació d'aproximadament el 34% i el 20%, respectivament. No obstant això, a una concentració de 10 mM, els ions Ca²⁺ van ser l'inhibidor més potent de la lacasa, reduint l'activitat enzimàtica en aproximadament un 60%.
L'efecte dels ions metàl·lics sobre l'activitat de la lacasa Pleurotus ostreatus NRC 620. La lacasa es va incubar durant 10 minuts en tampó de fosfat de sodi (0,05 M, pH 7,0) que contenia diversos ions metàl·lics a concentracions de 2,5 mM i 10 mM. La reacció es va iniciar amb l'addició del substrat (ABTS), després del qual es va mesurar l'activitat relativa.
Els nostres resultats són consistents amb els d'altres autors que van trobar que el Mg²⁺ i el Cu²⁺ augmenten l'activitat de *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ van trobar que la lacasa de *Xylaria* sp. és estimulada fins a cert punt pels ions de coure (Cu²⁺). A més, Foroutanfar et al.⁴⁹ i Si et al.⁵⁰ van dur a terme estudis similars sobre lacases de *Paraconiothyrium variabile* i *Trametes pubescens*, respectivament. El lloc d'unió al coure de tipus II (T2) d'aquest enzim es pot saturar amb Cu²⁺ a una concentració determinada, cosa que pot explicar l'estimulació de l'activitat de la lacasa a concentracions més altes de Cu²⁺³⁹. Com que les lacases dels fongs de la podridura blanca són oxidases que contenen múltiples àtoms de coure, els efectes dels ions de coure sobre l'activitat de la lacasa són diversos i van des d'estimulants i inhibidors fins a neutres.⁵¹ En canvi, Zhou et al.^[52]va informar que^Cu²⁺va inhibir l'activitat lacasa del tèrmit subterrani de Taiwan (Odontotermes formosanus). No obstant això, les lacasas de Cerena sp. HYB07^[53]i Clitocybe maxima^[54]no es van veure afectats pels ions de coure.
L'especificitat del substrat es va representar pels seus paràmetres cinètics (Km i Vmax); com més forta és l'afinitat d'unió del substrat a l'enzim, més baix és el valor de Km i més alta l'especificitat del substrat.^3,21,55Els paràmetres cinètics (Km i Vmax) de la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 es van determinar mitjançant el programari GraphPad Prism 6.0 representant el diagrama de Lineweaver-Burk (Figura 5). Quan es va utilitzar ABTS com a substrat, els resultats van ser 1,99 mM i 16217 μmol^{min⁻¹ L⁻¹,}respectivament. Elsayed et al.²¹va informar que els valors de Km per a l'oxidació d'ABTS eren de 0,1 mM i 0,064 mM, respectivament, cosa que indica una alta afinitat dels isoenzims Lac A i Lac B per ABTS. A més, els valors de Vmax van ser de 0,182 μmol^min⁻¹i 0,603 μmol^min⁻¹, respectivament. El valor de Km obtingut va ser inferior al de Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); a més, el seu valor de Vmax (1429 mmol min⁻¹) també va ser^{més baix}quan s'utilitza ABTS com a substrat.33 De la mateixa manera, els valors de Km de les concentracions de lacasa de Lentinus squarrosulus MR13 i Trametes sp. AH28-2 van ser de 0,0714 mM i 0,025 mM, respectivament, i els valors de Vmax van ser de 0,0091 mM min−1 i 0,67 mM min−1 mg−1 (en relació amb ABTS).^{, respectivament.56,57}
Es va investigar l'efecte de la concentració d'ABTS sobre l'activitat de la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, i es va representar un gràfic de Lineweaver-Burk del recíproc de la velocitat de reacció inicial en funció de la concentració d'ABTS. La reacció d'oxidació d'ABTS amb diferents concentracions (0,025–3,0 mM) de la casa es va mesurar a pH 4,5 per determinar els paràmetres cinètics (Vmax i Km). Les constants cinètiques de Michaelis-Menten es van calcular mitjançant el gràfic de Lineweaver-Burk del recíproc de la velocitat de reacció en funció de la concentració del substrat. Les constants cinètiques es van calcular a partir del gràfic de Lineweaver-Burk utilitzant el programari GraphPad Prism 6.01.
Els enzims clarificants tradicionals, com les pectinases, hidrolitzen les substàncies pèctiques, reduint la viscositat i la terbolesa. Descomponen eficaçment els polisacàrids estructurals i sovint s'utilitzen en combinació amb altres enzims, com ara les cel·lulases i les hemicel·lulases, per millorar el rendiment i la claredat. Tanmateix, les pectinases no es dirigeixen específicament als compostos fenòlics, que són els principals contribuents a la terbolesa i l'enfosquiment oxidatiu, especialment en sucs com el de poma i el de raïm.⁵⁸En canvi, les lacases catalitzen l'oxidació dels compostos fenòlics, polimeritzant-los en molècules insolubles més grans que es poden eliminar per sedimentació o filtració. Aquest mecanisme no només millora la claredat, sinó que també allarga la vida útil del suc reduint la probabilitat d'enfosquiment oxidatiu causat pels compostos fenòlics. A més, els processos de clarificació basats en lacases es poden dur a terme en condicions de processament suaus (pH 3,5-5,5, temperatura 25-40 °C), cosa que els fa adequats per a sucs delicats sense comprometre les seves propietats nutricionals o organolèptiques.⁵⁹Els estudis han demostrat que el tractament amb pectinasa pot clarificar el suc en 1-2 hores, mentre que el tractament amb lacasa normalment requereix un temps de reacció més llarg (3-6 hores) per reduir completament els compostos fenòlics. Tanmateix, aquest procés es pot optimitzar immobilitzant l'enzim o combinant la lacasa amb mètodes de clarificació mecànica.⁶⁰En aquest estudi, el perfil enzimàtic de l'extracte cru va revelar activitats significatives de laccasa i α-amilasa, mentre que les activitats de pectinasa i xilanasa van ser extremadament baixes i no es va detectar activitat de cel·lulasa. Per tant, la reducció de la terbolesa i el contingut fenòlic es va deure principalment a l'acció de la laccasa, mentre que el canvi de viscositat podria ser degut en part a l'acció de l'amilasa.
La Taula 1 mostra els paràmetres fisicoquímics del suc de poma acabat d'esprémer i de les mostres tractades amb lacasa. Els resultats van mostrar que el rendiment del suc de poma acabat d'esprémer (71,59%) va ser inferior al de les mostres tractades amb lacasa (87,34%). Aquests resultats són consistents amb les troballes de Pilnik i Orange.⁶¹, que va indicar que l'ús d'enzims en el processament de fruites pot augmentar el rendiment del suc, millorar la filtració i obtenir suc clar d'alta qualitat per a la concentració. L'augment del rendiment del suc es deu principalment a l'augment del contingut de sucres solubles en el suc. Durant la hidròlisi enzimàtica de les fruites, la mesoglea i la pectina de les parets cel·lulars del producte es destrueixen i es converteixen en substàncies solubles com ara sucres neutres i àcids.^62.El valor del pH del suc de poma tractat amb enzims va ser significativament inferior al del grup de control (P < 0,05), i el valor del pH d'ambdós grups va augmentar significativament durant l'emmagatzematge (Taula 1). Aquests resultats són consistents amb els de Mark et al.⁶³, que va observar que el pH del suc de fruita d'anacard disminuïa després de l'emmagatzematge després del tractament tèrmic. La degradació de la pectina i la formació d'àcid galacturònic després del tractament enzimàtic poden ser responsables de l'augment del pH durant l'emmagatzematge. El pH de les mostres tractades amb enzims es va mantenir entre 4,05 i 4,31 durant tot l'emmagatzematge, mentre que el pH del suc de poma sense tractament va oscil·lar entre 4,12 i 4,33.
L'acidesa total (AT) de les mostres no tractades i tractades amb lacasa va mostrar una tendència decreixent a mesura que augmentava el temps d'emmagatzematge (Taula 1). La disminució de l'acidesa es va atribuir a la conversió d'àcids orgànics en carbohidrats o a reaccions enzimàtiques, així com a l'oxidació durant l'emmagatzematge del suc.⁶⁴L'acidesa total del suc de poma de control i de les mostres tractades amb enzims va ser inferior a la d'altres sucs (suc de maduixa 0,9%, suc de pruna 2,2%, suc de kumquat 1,0%, suc d'albercoc 2,4%, suc de taronja 0,8%), però similar a la d'altres sucs (per exemple, suc de pera 0,3%).⁶²Aquestes diferències en el suc de poma acabat d'esprémer sense tractar poden ser degudes a diversos factors com ara les condicions de creixement, factors genètics, nivell de maduresa i mètodes de processament.⁶⁵La disminució de l'acidesa total del suc de poma de control i tractat amb lacasa és coherent amb els resultats presentats per Singh et al.⁶⁶pel que fa a la disminució de l'acidesa total del suc de poma Jin Nuo després de 74 dies d'emmagatzematge. D'altra banda, Oshmiansky i Wojdylo⁶⁷no van trobar cap canvi significatiu en l'acidesa del suc de poma en estudiar l'efecte dels mètodes tradicionals de clarificació.
Els resultats presentats a la Taula 1 indiquen que el valor de sòlids totals solubles (TSS) del suc de poma tractat amb lacasa era superior al de la mostra sense tractament. Aquests resultats són consistents amb els estudis publicats.^{. 68}A més, la Taula 1 mostra que el valor de TSS del grup de suc de poma de control era de 9,58 al punt de temps inicial i va arribar a 11,05 al final del període d'emmagatzematge. Aquests valors són inferiors als valors de TSS del suc de poma fresc reportats per Hamid et al.^{. 69}(11,2 i 11,80, respectivament). El valor de TSS de les mostres de suc de poma tractades amb lacasa va augmentar significativament, començant des d'11,23 i arribant a 12,93 després de dues setmanes d'emmagatzematge a 4 °C (Taula 1). També es va observar un augment similar del TSS durant l'emmagatzematge en cítrics, llimones i taronges dolces. L'augment dels sòlids solubles totals (TSS) durant l'emmagatzematge pot ser degut a la hidròlisi de polisacàrids (midó) a monosacàrids (sucres), l'augment de la concentració a causa de la deshidratació del suc i la degradació de la pectina del suc a sòlids solubles. L'augment dels sòlids solubles totals (TSS) probablement es deu a l'augment dels sucres solubles, que es poden formar per la conversió de pectina o cel·lulosa a sucres solubles per pectina o cel·lulasa, respectivament, o per la hidròlisi del midó a sucres, tal com van informar Hamed et al.^69.L'efecte de la lacasa sobre les propietats del suc de poma es pot observar visualment, ja que el suc de poma tractat amb lacasa presenta una millor fluïdesa i una viscositat més baixa que el suc sense tractament. Aquesta observació es registra a la Taula 1; la viscositat de la mostra tractada amb enzims va ser d'1,87 cP, mentre que la viscositat de la mostra de control va ser de 2,95 cP. Aquesta disminució significativa de la viscositat és probablement deguda a la major capacitat de retenció d'aigua de les substàncies semblants a la pectina i a la formació d'una estructura de xarxa cohesiva.
En aquest estudi, es va investigar l'efecte de la lacasa sobre l'índex d'enfosquiment (IB) del suc de poma mesurant l'absorbància a 420 nm amb un espectrofotòmetre. Els resultats es mostren a la Taula 1. Durant l'emmagatzematge, l'IB de les mostres de suc de poma, tant en el grup tractat com en el no tractat, va mostrar una tendència a l'augment gradual. L'IB reflecteix el grau d'enfosquiment i pot servir com a^{un important}indicador de reaccions d'enfosquiment enzimàtiques i no enzimàtiques. L'absorbància va augmentar significativament durant l'emmagatzematge (P < 0,05). Al final de l'emmagatzematge, el_A420El valor de les mostres de suc de poma en els grups de control i tractats amb enzims va augmentar aproximadament un 217% i un 121%, respectivament (Taula 1). Els resultats indiquen que el tractament enzimàtic pot reduir eficaçment el grau d'enfosquiment en aproximadament un 56%. Els resultats de Bezerra et al.^[19] són consistents amb els nostres resultats; Van utilitzar lacasa-glutaraldehid-fibra de coco per clarificar el suc de poma, reduint el seu color original en un 61%.
Tot i que els polifenols dels sucs de fruita tenen efectes nutricionals i terapèutics positius sobre el cos humà, també poden reaccionar amb les proteïnes, causant terbolesa, sedimentació o terbolesa del suc, alterant així el sabor i l'aroma del producte i reduint-ne la vida útil.⁷¹L'objectiu d'aquest estudi era reduir de manera segura el contingut de compostos fenòlics del suc de poma utilitzant lacasa de Pleurotus ostreatus NRC 620. Els resultats presentats a la Taula 1 mostren que el contingut total de compostos fenòlics del suc de poma tractat amb lacasa es va reduir significativament abans de l'emmagatzematge a 4 °C. A més, el contingut total de compostos fenòlics també va disminuir durant l'emmagatzematge en ambdues mostres estudiades (Taula 1). Recerca de Sandri et al.⁷²va demostrar que el suc de poma tractat amb enzims pot conservar la seva activitat antioxidant i el contingut de compostos fenòlics. Tanmateix, els resultats d'un estudi de Lettera et al.⁷³demostren que el tractament del suc de taronja amb lacasa fúngica pot reduir el contingut de compostos fenòlics fins a un 45%.
S'ha demostrat que els compostos fenòlics tenen propietats com la captura de radicals lliures, la reducció i l'extinció d'oxigen singlet, la transferència d'àtoms d'hidrogen i la donació d'electrons als radicals lliures, cosa que els converteix en uns antioxidants potents.⁷⁴Per tant, en aquest estudi, es van utilitzar mètodes basats en DPPH i FRAP per avaluar l'efecte de la lacasa sobre l'activitat antioxidant del suc de poma emmagatzemat a la nevera durant 14 dies (Taula 2). Ambdós mètodes van mostrar un augment de l'activitat antioxidant durant l'emmagatzematge, que pot ser degut a l'augment de compostos fenòlics lliures o a la formació de productes de reacció de Maillard (MRP), sent els productes de reacció de Maillard probablement la causa de l'augment de l'activitat antioxidant.⁷⁵Les reaccions d'enfosquiment no enzimàtiques (inclosa la degradació de l'àcid ascòrbic, les reaccions de Maillard i la degradació de sucres catalitzada per àcids) produeixen pigments marrons (melanoidines). Els productes intermedis de degradació de l'àcid ascòrbic i els productes de degradació del sucre (com ara els compostos carbonílics) poden reaccionar amb els aminoàcids mitjançant reaccions de Maillard.⁷⁶Tot i que l'enfosquiment de fruites i verdures durant l'emmagatzematge s'ha estudiat àmpliament, la nostra comprensió d'aquestes reaccions continua sent limitada.⁷⁷En comparació amb el mètode FRAP, el suc de poma tractat amb lacasa va mostrar una activitat antioxidant significativament menor mitjançant el mètode DPPH (Taula 2), i l'activitat antioxidant de totes les mostres va augmentar significativament amb l'augment del temps d'emmagatzematge. En aquest estudi es van utilitzar dos mètodes diferents per determinar l'activitat antioxidant perquè els seus principis difereixen. El mètode DPPH mesura la capacitat de neutralitzar els radicals lliures, mentre que el mètode FRAP mesura la capacitat de reduir els ions de ferro. Per tant, es recomana utilitzar múltiples mètodes per determinar l'activitat antioxidant per entendre millor l'activitat antioxidant de les mostres estudiades.⁷⁸
Una de les troballes clau d'aquest estudi és que la lacasa *Pleurotus ostreatus* NRC 620 presenta una activitat òptima a 70 °C i un pH de 3,0. En comparació amb altres lacases fúngiques que s'utilitzen habitualment per a la clarificació de sucs, com ara les lacases *Trametes versicolor* i *Ganoderma lucidum*, la *P. ostreatus* NRC 620 presenta una major estabilitat tèrmica i un pH més àcid. Les lacases de *Trametes versicolor* i *Ganoderma lucidum* solen presentar una activitat òptima en el rang de 50-60 °C i a valors de pH entre 3,5 i 5,0. Aquesta diferència pot contribuir a una millora de l'eficiència de la clarificació del suc, especialment per a sucs àcids on l'estabilitat a valors de pH més baixos és crítica. La característica única de *P. En comparació amb altres lacases fúngiques estudiades, la *Pleurotus ostreatus* NRC 620 presenta la capacitat de funcionar eficaçment en condicions més difícils. La seva temperatura d'activitat òptima més alta suggereix possibles avantatges en aplicacions industrials, com ara taxes de reacció més ràpides i una contaminació microbiana reduïda. El seu pH baix, que s'adapta bé a la naturalesa àcida de molts sucs, pot ser útil en els processos de clarificació de sucs. Aquests resultats justifiquen una exploració més profunda per a l'aplicació a gran escala, cosa que converteix *Pleurotus ostreatus* NRC 620 en una alternativa viable a les fonts tradicionals de lacasa fúngica. En comparació amb estudis anteriors, hem trobat que la temperatura òptima és de 60 °C i el pH òptim és de 3,0. Després de la reacció a 60 °C durant 80 minuts, la lacasa de *Ganoderma lucidum* va retenir...⁴⁶% de la seva activitat.79 Segons Kurniawati i Nicelle⁸⁰Els enzims *Ganoderma lucidum* presenten una estabilitat excel·lent a moderada a 25 °C i valors de pH que oscil·len entre 5,0 i 8,0, i estabilitat a pH 6,0 i temperatures que oscil·len entre 10 i 30 °C. En aquest estudi, vam trobar que el pH i la temperatura òptims per a l'activitat enzimàtica per a *Pleurotus ostreatus* eren 3,0 i 70 °C, respectivament. Després de la incubació a 40 °C i 50 °C durant dues hores, l'enzim va retenir el 68,33% i el 59,61% de la seva activitat, respectivament. A més, la lacasa Pleurotus ostreatus NRC 620 va mostrar una alta activitat en un ampli rang de temperatura de 50 °C a 80 °C, gairebé assolint l'activitat màxima (69%-98%), amb una activitat màxima observada a 70 °C.
En conclusió, la lacasa de bolet ostra NRC620, obtinguda en condicions estàtiques, va demostrar una activitat i estabilitat òptimes en un rang de condicions de pH i temperatura, demostrant una estabilitat superior en comparació amb altres fonts d'enzims. L'addició de 10 mM de MgSO₄ i CuSO₄ va augmentar l'activitat enzimàtica aproximadament en un 21% i un 35%, respectivament. Quan es va processar en suc de poma, l'enzim va reduir el pH i la viscositat, mentre que el contingut fenòlic va disminuir només lleugerament durant l'emmagatzematge.
Els resultats confirmen el potencial de la lacasa en la indústria alimentària, especialment en la clarificació de begudes. En descompondre específicament els compostos fenòlics, la lacasa no només redueix la terbolesa i millora la claredat, sinó que també manté la qualitat dels sucs de fruita en condicions d'operació suaus. A diferència dels agents clarificants tradicionals com la gelatina, la bentonita i el gel de sílice, la lacasa no genera residus ni elimina aromes agradables de les begudes, cosa que la converteix en una opció més respectuosa amb el medi ambient i sostenible. A més, en comparació amb altres enzims i mètodes de filtració, la lacasa ofereix una solució específica i rendible sense comprometre la qualitat del producte.
Kyomuhimbo, HD i Brink, HG. Aplicacions i estratègies d'immobilització de lacases que contenen coure; una revisió. Heliyon 9, e13156 (2023).